屬性分析是什麼
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1976年單克隆抗體技術被Georges Khler和 César Milstein發明，之後經歷了鼠源、嵌合、人源化和全人源 4 個主要發展階段，由於鼠源和嵌合單抗會產生人抗鼠抗體反應，所以人源化和全人源單抗已成為生物技術企業研發的主流。單抗的分子量高達 150 kDa 左右，結構複雜，其質控相比較於小分子藥物要求更高。
以單抗技術為基礎，又相繼開發了抗體偶聯藥物、多特異性抗體藥物、奈米抗體等多種新興技術，如何全面表徵抗體藥物的關鍵質量屬性，成為抗體藥物開發的關鍵點和難點。本系列文章分為上下兩篇，上篇重點是理化屬性，集中在抗體藥物結構、電荷及分子量大小變異體、糖異質性、工藝相關雜質、聚集體分析，下篇重點為活性分析，包括結合活性和生物學活性等。
理化屬性表徵
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抗體藥物結構
抗體藥物結構表徵主要包括以下引數：
1）完整分子量
2）輕鏈分子量
3）重鏈分子量
4）氨基酸序列
5）二硫鍵
6）自由巰基
7）糖基化位點
8）N-端測序
9）翻譯後修飾
10）二、三級結構表徵
在前9項一級結構表徵中，LC/MS是最主要和最基礎的表徵方法，二三級結構涉及使用圓二色譜，紅外光譜等，細節不作贅述。
抗體結構表徵的目的，除了全面表徵抗體藥物質量，另外一個核心目標是尋找可能影響抗體藥物療效的關鍵氨基酸殘基、關鍵氨基酸的翻譯後修飾，進行相關工藝改造和確認，避免在工藝開發後期以及臨床階段，產生不良影響，也是本文主要的討論內容，主要包括：脫醯胺，異構化，Met和Trp氧化，未配對的半胱氨酸等。
1.1 脫醯胺
天冬醯胺（Asn），尤其是CDR區的Asn殘基脫醯胺，是單克隆抗體藥物最常遇到的降解途徑之一。當Asn後面是小的且活躍的甘氨酸（Gly）殘基（NG基序）時，容易發生脫醯胺，並且如果發生在CDR區，會導致對抗原結合親和力降低，抗體效力喪失。因而在抗體測序和生物資訊學評估時，需要關注CDR區的Asn-Gly殘基，並在強制降解階段對其進行評估。
此外在IgG的Fc段“ PENNY”環肽中，也包含脫醯胺易感位點，但是因為通常不會對抗體藥物結合抗原帶來負面影響，一般不做重點關注。
1.2 氨基酸氧化
蛋氨酸（Met）和色氨酸（Trp）殘基容易發生氧化。其中重鏈CDR2中的蛋氨酸以及Fc區中的蛋氨酸氧化並不會影響抗原結合。但是當氧化水平較高，或者發生在抗原結合的關鍵CDR區域，會降低抗原結合能力，降低抗體藥物的有效性。
靠近CH2-CH3區域的蛋氨酸殘基易發生氧化，導致熱穩定性下降，聚集增加，補體依賴性細胞毒性（CDC）下降，與FcRn的結合親和力下降以及體內半衰期縮短。
CDR中Trp殘基的氧化，可能導致有效性降低，熱穩定性降低和聚集傾向增加。
總體而言，生物資訊學分析和一級序列測定時，應重點關注CDR區Met和Trp的氧化，並確定它們的敏感性，必要時在工藝階段採取適度控制策略。
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Asp異構化是單克隆抗體藥物的另一種降解途徑。CDR區的Asp殘基，如果後面是Gly殘基，His或Ser時，通常易於異構化。CDR區發生異構化，可能導致抗原結合親和力降低。當pH值在5左右時，有利於Asp異構化，因此抗體藥物的製劑配方開發時，需要注意其pH值儘可能避開5。
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IgG CH2 Asn-297連線的N糖為核心7糖結構，四個N-乙醯葡糖胺（GlcNAc）和三個甘露糖（Mannose）殘基。根據抗體的功能需要，會對抗體的糖型進行改造，以獲取相應的功能特性，以及延長或縮短抗體半衰期等。因而糖基位點檢測分析貫穿於抗體藥物工藝的整個過程，也是質量放行的關鍵質量屬性。
▲Biologicals （2017）
抗體糖工程改造主要有巖藻糖基化，乙醯葡糖胺化，半乳糖基化，唾液酸化四種。
透過核心巖藻糖基轉移酶（Fut8）催化N-聚糖GlcNAc核心巖藻糖基化；透過乙醯葡糖胺基轉
移酶3（GNT3）在分支角Mannose上新增乙醯葡糖胺（GlcNAc）；透過β-1，4-半乳糖轉移酶1（b4GALT1）在七糖末端的兩個GlcNAc新增半乳糖，使其半乳糖化。這三種策略是改變和1型FcγR的結合。在核心巖藻糖基化以及半乳糖基化的基礎上，在
α2，6-唾液酸轉移酶（ST6GAL1），可以增加抗體的唾液酸化，唾液酸化則可以增加和
2型FcγR的結合。
糖異質性分析，通常使用LC/MS對於糖型進行鑑定，使用HILIC-FLD進行糖型定量分析，使用硼酸親和色譜進行糖化檢測。
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未配對的半胱氨酸會增加抗體的異質性，並可能對化學和熱穩定、生物功能、聚體形成，抗原結合效力和蛋白摺疊產生重大影響。單克隆抗體在CDR區可能具有未配對的半胱氨酸（Cys）殘基，不過比較少見。未配對的Cys很容易地在細胞培養基中被遊離的半胱氨酸修飾，會降低抗原結合親和力。因此，未配對的半胱氨酸應視為質量屬性進行常規監測和表徵，以確保結構完整性和產品質量。
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氨基酸
氨基酸
重組抗體在培養工藝、純化、製劑等階段都容易引入抗體大小變異體和電荷變異體。抗體大小變異體和電荷變異體是抗體鑑別和一致性評價的重要指標。
大小變異體檢測常用方法包括分子量排阻色譜，CE-SDS（2015版藥典收錄，2020版做了修訂）。
抗體藥物的電荷變化反映了各種蛋白質翻譯後修飾的總和，對工藝改變的過程非常敏感，在整個開發過程中都需要密切監測，以確保一致性。常用的表徵方法包括離子交換色譜法和等電聚焦法（2020版藥典收錄），檢測指標包括等電點和酸鹼變異體。
氧化
氧化
1.3 Asp異構化
抗體分子因為翻譯後修飾、運輸等的剪下力、雜質、pH值變化等引起蛋白質空間改變，形成空間互補、電荷互補，易產生聚集體。聚集體（或聚集顆粒）是最常見的產品相關的雜質。抗體聚集會增加抗體藥物免疫原性，促進抗藥物抗體產生，降低藥物療效，所以需要進行密切監控。
▲THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 2011
常用的分析方法包括：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）或毛細管電泳（CE-SDS），用於在變性條件下還原或非還原下測定mAb單體，片段和共價聚集體。體積排阻色譜法（SEC）也是確定單克隆抗體的高分子量聚集物（例如二聚體，三聚體或低聚物）的最常用方法。
對於大型聚集體（顆粒物），可以使用光散射來表徵<1nm至1-10μm範圍內的顆粒，比如常用的DLS方法，目前對於顆粒物，藥典的檢測方法包括光阻法（例如HIAC）和顯微計數法。微流體成像技術，則被用於大於2-100μm的顆粒物，可以一定程度上區分蛋白質聚集顆粒物和其他異物。
1.3 Asp
異構化
1.4 糖基化位點
工藝相關雜質，是指由生產工藝引入的雜質，主要包括宿主細胞殘留的DNA和蛋白質，以及純化時引入的蛋白A。宿主蛋白雖然不會引起嚴重的過敏反應等副作用，但確是工藝（尤其是純化工藝）非常好的質控指標，所以一直是抗體藥物表徵的關鍵質量引數。
宿主DNA最常用的方法是定量PCR法，而宿主蛋白殘留，一般推薦使用方法為ELISA法，但有時ELISA法的蛋白質覆蓋度有不足，通常會結合使用質譜法和特定蛋白質的Western blot方法，以達到完整的覆蓋。對於殘留的蛋白A，通常使用ELISA法進行檢測。
1.4
糖基化位點
除去上述關鍵的質量引數，此外尚有pH值、滲透壓、外觀、粘度等指標用於表徵抗體藥物的一般屬性，可以參考藥典給出的標準方法進行測定。
糖基化位點
抗體藥物因為分子量是小分子藥物的數百倍，且因表達體系，工藝流程容易引入蛋白質翻譯後修飾變化，大小變異體，電荷變異體，甚至會聚集形成顆粒等，對於質量表徵提出了非常高的要求，本文分析了部分對於產品質量，尤其是會影響最終療效的引數做了簡要的梳理。
康日百奧分析實驗室擁有Thermo Orbitrap Exactive HF-X液質聯用儀，Thermo Vanquish UHPLC， Protein Simple Maurice， SCIEX PA800 plus， Waters ACQUITY H Class UPLC， Thermo CAD檢測器， Malvern全自動毛細管差示掃描量熱儀，Octet分子間相互作用儀，MD M5酶標儀，Roche480 qPCR儀等先進研究和檢測裝置，可對單克隆抗體，雙抗，融合蛋白，ADC等生物藥進行分析方法開發、確認和驗證，並提供全面的蛋白表徵研究（包含工藝可比性研究，生物類似藥的相似性評價等）。為抗體藥物研發同仁提供優質的，可靠的服務。
主要參考資料
1。 Xiaojie Yu et al，Improving Antibody-Based Cancer Therapeutics Through Glycan Engineering，BioDrugs DOI 10。1007/s40259-017-0223-8
2。 Yingda Xu et al，Structure， heterogeneity and developability assessment of therapeutic antibodies，mAbs，2018
3。 Cymer， F。， Therapeutic monoclonal antibody N-glycosylation – Structure， function and therapeutic potential， Biologicals （2017）， https：//doi。org/10。1016/j。biologicals。2017。11。001
4。 Classification and Characterization of Therapeutic Antibody Aggregates ，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL。 286， NO。 28， pp。 25118–25133， July 15， 2011
1.5 未配對的半胱氨酸（Cys）殘基
康日百奧生物科技（蘇州）有限公司是一家專業的生物藥CDMO。公司服務範圍包括細胞株開發、原液和製劑工藝開發、分析方法開發，製劑處方開發以及原液和成品的cGMP生產。團隊成員均為經驗豐富的生物製藥行業資深人士，對生物藥CMC領域有著深刻的理解。他們在業界領先的生物製藥研發和生產企業所積累的豐富經驗是康日百奧得以快速建立併為客戶提供優質服務的關鍵。已成功幫助多個合作伙伴專案獲得中國，美國，澳大利亞等的臨床批件。
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