免疫熒光染色診斷怎麼查
近日，
同濟大學附屬上海市肺科醫院姜格寧/徐建芳/鄭迪教授團隊和思路迪轉化醫學研究團隊合作的科研成果以RESEARCH ARTICLE形式線上發表於醫學、生命科學與奈米科學領域知名雜誌《Journal of Nanobiotechnology》（IF=10.435）。
該研究首次揭示了不確定性肺結節患者血漿外泌體（一種小胞外囊泡）來源miRNA特徵，並發現和驗證了基於血漿外泌體miRNA模型CirsEV-miR可用於預測不確定性肺結節的良惡性，
助力肺癌早診。
同時，該研究還首次報道了患者的血漿外泌體miRNA表達譜隨腫瘤惡性程度增加（良性結節、原位腺癌/微浸潤腺癌和浸潤性腺癌）而逐漸變化。
這是繼轉化醫學研究團隊與臨床專家基於上海思路迪生物技術有限公司（思路迪診斷）自主研發的外泌體底層技術合作開展肺癌早診探索，
並在國際胞外囊泡領域權威雜誌《Journal of Extracellular Vesicles》（IF=25。841）
（【思路迪外泌體研究4】 | 鍾文昭/吳一龍教授團隊與思路迪合作揭示血漿外泌體miRNA助力肺癌早診）
共同發表肺癌早診科研成果之後，
思路迪再一次在肺癌早期診斷標誌物發現中取得突破。
研究背景
肺癌是世界上最常見、發病率和病死率均最高的惡性腫瘤。隨著低劑量螺旋CT（low-dose computed tomography， LDCT）的普及，肺結節的檢出率有了明顯提升。然而，許多肺結節僅透過LDCT難以判斷良惡性，被稱為不確定性肺結節（indeterminate pulmonary nodules， IPNs）。雖然LDCT敏感性極高，但特異性較差，這導致許多實際為良性肺結節進行了不必要的手術切除，同時給患者帶來額外的風險與開支。因此，透過非侵入性檢測區分IPNs良惡性，對肺結節的臨床診斷及後續治療都非常重要。外泌體是由多種細胞分泌至胞外的一種小型胞外囊泡，直徑約30-150 nm，包含核酸、蛋白質、脂質等活性物質，具有介導細胞間資訊傳遞的功能，並且攜帶來自於供體細胞的特徵，目前已成為液體活檢領域的熱點。研究表明，與正常細胞相比，肺癌細胞能分泌更多的外泌體，且肺癌患者來源的血漿外泌體中所包含的miRNA與健康人有很大不同。但這些研究都聚焦於從健康人群中區分出肺癌患者，而非著重於研究區分良惡性結節。Zhang等嘗試透過血漿外泌體miRNA區分良性結節與惡性磨玻璃樣肺結節，但並未深入研究良惡性結節之間生物學差異。因此，在LDCT檢測發現IPNs後，採用非侵入性檢測手段準確區分IPNs的良惡性對於肺癌臨床診治非常重要，有待深入研究。
研究設計
該研究計劃評估LDCT檢測IPN患者血漿外泌體miRNAs的分子特徵與潛在診斷價值，從同濟大學附屬上海市肺科醫院共招募了459例患者並收集其手術前血液樣本。去除不符合入組條件患者後，最終納入109例IPN患者（訓練組47例，測試組62例）（圖1）。訓練組中，良性肺結節患者17例，惡性肺結節患者30例；測試組中，良性肺結節患者24例，惡性肺結節患者38例。該研究採用思路迪診斷自主研發的外泌體分離試劑來分離患者血漿中外泌體，並利用小RNA測序技術檢測患者血漿外泌體miRNAs表達譜，透過LASSO方法構建CirsEV-miR診斷模型，並在外部驗證組99例IPN患者中驗證CirsEV-miR模型效能。總體上，該研究分析了共208例IPN患者的血漿外泌體miRNAs，並採用TCGA資料庫中490例患者的資料進行生存分析。該研究已獲得同濟大學附屬上海市肺科醫院倫理委員會的批准（K18-199Y），入組的患者均已簽署知情同意書；並已在中國臨床試驗註冊中心（Chinese Clinical Trial Registry）完成註冊（註冊號：ChiCTR1800019877）。
圖1。 研究設計
研究發現
1.血漿外泌體特徵鑑定
該研究採用思路迪診斷自助研發的外泌體分離試劑提取IPN患者血漿外泌體，進一步透過免疫印跡檢測（WB）、奈米粒子跟蹤分析（NTA）和透射電鏡掃描技術（TEM）對分離所得的外泌體進行特徵鑑定，並透過免疫熒光染色技術對外泌體膜蛋白標誌物（CD63、CD9和CD81）進行檢測，發現抽提所得胞外囊泡在特徵蛋白表達、囊泡直徑分佈、形態特徵和膜蛋白標誌物特徵都符合外泌體特徵（圖2），表明該研究分離IPN患者血漿得到的胞外囊泡主要為外泌體。
圖2。外泌體特徵鑑定
a。 外泌體特徵蛋白WB檢測；b。 NTA結果；
c。 透射電鏡檢測；d。 外泌體免疫熒光染色結果。
2. CirsEV-miR模型構建與驗證
該研究透過LASSO方法構建CirsEV-miR模型。首先，透過無差別聚類分析IPN患者血漿外泌體miRNA資料，發現良性結節患者與惡性結節患者血漿外泌體miRNA表達譜差別較大（圖3a）。之後，在訓練組中挑選6個差異表達miRNAs（DEMs）進行模型構建（圖3b），並透過繪製單個miRNA或多個miRNA組合區分良惡性肺結節的ROC曲線並計算其AUC（圖3c），發現透過LASSO方法基於5個miRNAs（let-7b-3p、miR-101-3p、miR-125b-5p、miR-150-5p和miR-3168）建立的CirsEV-miRNA模型效能最高，AUC達到0。920（圖3d）。根據CirsEV-miR模型計算打分，發現惡性肺結節患者的CirsEV-miR分值明顯高於良性肺結節患者（圖3e）。在測試組和驗證組中，CirsEV-miR區分效果被進一步測試和驗證。
圖3。 區分良惡性IPNs模型構建
a。 訓練組血漿外泌體miRNA表達譜無差別聚類分析；
b。 訓練組中6個DEMs表達水平；c。 6個DEM組合模型ROC；
d。 訓練組中CirsEV-miR模型ROC；
e。 訓練組中CirsEV-miR模型分值。
3.CirsEV-miR模型miRNA生物學功能分析
我們對CirsEV-miR模型5個miRNAs的靶基因進行了GO和KEGG訊號通路分析，發現這些靶基因富集於腫瘤發生與進展過程相關的訊號通路，例如MAPK、TGFβ、Hippo、p53相關訊號通路、細胞週期和胞間黏附等生物學過程。此外，透過對TCGA資料庫中490例肺腺癌患者資料進行分析，發現miR-101-3p或miR-150-5p與患者總生存相關（圖4e，圖4f）。
圖4。 CirsEV-miR模型DEM靶基因功能及生存分析
a。 靶基因生物學過程分析；b。 靶基因細胞組成和分子功能分析；
c。 靶基因KEGG訊號通路分析；d。 各訊號通路中靶基因數量；
e。 TCGA資料庫中肺腺癌患者miR-101-3p總生存分析；
f。 TCGA資料庫中肺腺癌患者miR-150-5p總生存分析。
4.血漿外泌體miRNA特徵區分直徑小於1 cm的IPNs
臨床上，直徑超過1 cm肺結節需要切除，而直徑小於1 cm肺結節需定期隨訪。按照肺結節直徑是否超過1 cm，109例IPN患者被分為兩組，並比較兩組之間CirsEV-miR分值是否存在差異。直徑超過1 cm的IPN組CirsEV-miR分值顯著高於直徑小於1 cm的IPN組（圖5a）。而在直徑小於1 cm的IPN中，惡性肺結節的CirsEV-miR分值也明顯高於良性肺結節（圖5b）。在直徑小於1 cm的IPN患者中，CirsEV-miR模型的AUC達到0。767，特異性達到91。7%；在外部驗證組中AUC達到0。721，特異性達到75%（圖5c）。在直徑小於1 cm的IPN患者中，血漿外泌體miRNA表達譜在良性肺結節和惡性肺結節之間也存在差異。
圖5。 CirsEV-miR模型分值隨IPNs直徑增加而上升
a。 直徑≤ 1 cm和直徑> 1 cm的IPNs患者CirsEV-miR模型分值；
b。 直徑≤ 1 cm的IPN患者CirsEV-miR模型分值；
c。 直徑≤ 1 cm的IPN患者中模型敏感性與特異性；
d。 直徑≤ 1 cm的IPN患者血漿外泌體miRNA表達熱圖；
e。 直徑≤ 1 cm的良、惡性肺結節患者差異表達的血漿外泌體miRNAs。
5.AIS/MIA影響良惡性肺結節區分
原位腺癌（AIS）和微浸潤腺癌（MIA）是早期肺癌，與浸潤性腺癌相比患者預後情況更好。109位患者被分為良性結節組（n = 41，37。6%）、AIS/MIA組（n = 30，27。5%）和浸潤性腺癌組（n = 38，34。9%），CirsEV-miR分值在隨惡性程度增加而上升，血漿外泌體miRNA表達譜也隨惡性程度增加而逐步變化，AIS/MIA組CirsEV-miR分值與血漿外泌體miRNA表達譜均介於良性結節組與浸潤性腺癌組之間（圖6a，圖6b，圖6c）。透過比較三組DEMs發現，AIS/MIA與浸潤性腺癌組血漿外泌體miRNA表達情況既有相似之處，又有其獨特特徵。透過對TCGA資料控中490例患者資料分析發現，5條DEMs（miR-30c-5p、miR-30e-5p、miR-500a-3p、miR-125a-5p和miR-99a-5p）與患者總生存期明顯相關（圖6f）。上述結果表明，AIS/MIA影響良、惡性肺結節的區分，AIS/MIA患者表現出介於良、惡性肺結節患者之間的血漿外泌體miRNA分子特徵。
圖6。 AIS/MIA分子特徵介於良性和惡性肺結節之間
a。 良性結節、AIS/MIA和浸潤性腺癌的CirsEV-miR模型分值；
b。 良性結節、AIS/MIA和浸潤性腺癌血漿外泌體miRNA熱圖；
c。 良性結節、AIS/MIA和浸潤性腺癌中模型DEM表達水平；
d。 表達上調miRNAs的Venn圖；e。 表達下調miRNAs的Venn圖；
f。 TCGA資料庫中miR-30c-5p、miR-30e-5p、miR-500a-3p、miR-125a-5p和miR-99a-5p總生存分析。
研究結論
該研究利用血漿外泌體miRNA構建了區分IPN患者良惡性的診斷模型，該模型對直徑小於1 cm的肺結節也有區分良惡性能力。該研究發現進一步支援了AIS/MIA是良性肺結節和浸潤型肺腺癌的中間狀態，並有其自身分子特徵。這表明血漿外泌體miRNA可作為IPN診斷的生物標誌物，協助LDCT進行IPN的良惡性評估。進一步揭示了從血漿外泌體miRNAs中開發肺癌早期診斷生物標誌物的巨大潛力。
圖7。 研究總結
參考文獻
Identification and evaluation of circulating small extracellular vesicle microRNAs as diagnostic biomarkers for patients with indeterminate pulmonary nodules。 J Nanobiotechnology。 2022 Apr 2；20（1）：172。
思路迪外泌體
思路迪在外泌體臨床應用方面的探索是國內首家。早在2015年，思路迪就成立外泌體研發團隊，攻關在液體活檢領域外泌體標誌物檢測的一系列底層技術，並率先突破了外泌體提取和純化的難題，同時建立了3套外泌體提取技術，可適應不同的使用場景：1）試劑法：透過大分子-陽離子聚合物選擇性的結合磷脂雙分子層，使外泌體聚集沉澱，透過離心分離即可得到外泌體，同時顯著降低各型別脂蛋白（lipoprotein）的干擾，大分子-陽離子緩衝體系可以相容高血糖、高血脂、高（血）尿酸的血液樣本。這種方法靈活性高，既可在EP管中做微量科研樣本的分析，也可在96孔板中，結合臺式離心機即可實現最高每兩小時處理960個樣本。2）磁珠法：使用表面修飾的磁珠直接捕獲體液樣本中外泌體，且保留了外泌體完整的結構和生物活性，方便進行後續功能學研究，包括基於外泌體的藥物治療。此外，磁珠法最大的優點還在於它可同時進行外泌體分離和標誌物的檢測，這也表明其非常適合於發展成全自動的提取檢測工作站。3）流控排阻法，透過類似洗衣機滾筒的原理，多重迴圈流控實現逆向排阻篩選，可以分離大體積樣本中的外泌體，適用於尿液的外泌體研究。
同時，基於思路迪自主研發的外泌體檢測技術和研究平臺，轉化醫學研究團隊與多位臨床專家共同展開了一系列腫瘤早期診斷生物標誌物探索，前期已在
肺癌
（【思路迪外泌體研究4】 | 鍾文昭/吳一龍教授團隊與思路迪合作揭示血漿外泌體miRNA助力肺癌早診）
、
肝癌
（【思路迪外泌體研究5】 | 湘雅醫院李年豐教授團隊與思路迪合作揭示血液外泌體miRNA助力肝癌早診）
、
胰腺癌
（【思路迪外泌體研究6】 |突破！新的生物標誌物助力胰腺癌早診）
和
卵巢癌
中取得多次突破，後續還將會進行系列報道包括
卵巢癌
、
尿路上皮癌
和
肺癌
等惡性腫瘤早診的轉化研究成果。