怎樣用primer設計引物
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PCR技術全稱Polymerase Chain Reaction聚合酶鏈式反應
，是一種用於放大擴增特定的
DNA
片段的
分子生物學技術
，最大特點是在掌握少量
DNA
的情況下能迅速進行大量擴增，從而用於更廣泛的生物學用途。上次菌菌就給大家詳細科普過
PCR
技術擴增的原理，大家可以戳連結
【星耀小課堂】
PCR
擴增技術原理
回顧學習哦，今天菌菌就來履行承諾給大家更新
PCR
的引物設計原則啦。
PCR反應主要五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。其中引物是根據已知的一段DN模板序列來人工設計合成以氫鍵互補的兩段寡核苷酸序列，一個引物與靶基因一條DNA模板鏈互補，另一個引物與目的基因另一端的另一條DNA模板鏈互補，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點，DNA聚合酶可由其3‘端開始合成新的核酸鏈。
引物設計的基本原則如下：
首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或髮夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發
DNA
聚合反應
（
即錯配
）
。具體實現這
3
條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度（
primer length
），產物長度（
product length
），序列
Tm
值
（melting temperature）
，引物與模板形成雙鏈的內部穩定性
（internal stability， G
值反映
）
，形成引物二聚體
（primer dimer）
及髮夾結構（
duplexformation and hairpin
）的能值，在錯配位點（
false priming site
）的引發效率，引物及產物的
GC
含量（
composition
），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加
限制性內切酶
位點，引進突變等。
最佳區域
DNA
序列的保守區是透過物種間相似序列的比較確定的。在
NCBI
上搜索不同物種的同一
基因
，透過序列分析軟體（比如
DNAman
）比對（
Alignment
），各基因相同的序列就是該基因的保守區。
長度
引物長度（
primer length
）常用的是
15-30bp
，常用為
20bp
左右。不應過長，過長會導致其延伸溫度大於
74
℃，不適合
Taq
DNA
聚合酶
進行反應。
引物鹼基之GC含量
引物序列的
GC
含量以
40-60%
為宜，過高或過低都不利於引發反應：
G+C
太少擴增效果不佳，
G+C
過多易出現非特異條帶。上下游引物的
GC
含量不能相差太大。
Tm
值
引物所對應模板位置序列的
Tm
值
Tm
值的計算有多種方法，如按公式
Tm=4（G+C）+2（A+T）
，在
Oligo
軟體中使用的是最鄰近法
（the nearestneighbor method）
。
引物鹼基之隨機分佈
引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是
3’
端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發（
False priming
）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種鹼基的分佈最好是隨機的，不要有聚
嘌呤
或聚
嘧啶
的存在。尤其
3′
端不應超過
3
個連續的
G
或
C
，因為這樣會使引物在
GC
富集序列區錯誤引發。
3′端避開密碼子第3位
如擴增編碼區域，引物
3′
端不要終止於密碼子的第
3
位，因密碼子的第
3
位易發生
簡併
，會影響擴增的特異性與效率。
選擇T
引物
3′
端錯配時，不同鹼基
引發效率
存在著很大的差異，當末位的鹼基為
A
時，即使在錯配的情況下，也能有引發鏈的合成，而當末位鏈為
T
時，錯配的引發效率大大降低，
G
、
C
錯配的引發效率介於
A
、
T
之間，所以
3′
端最好選擇
T
。
自身避免互補
引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會摺疊成
髮夾結構
（
Hairpin
）使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續
4
個
鹼基
的互補。
兩個引物之間也不應存在互補序列，尤其是避免
3 ′
端的互補重疊以防止
引物二聚體
（
Dimer
與
Cross dimer
）的形成。引物之間不能有連續
4
個鹼基的互補。引物二聚體及髮夾結構如果不可避免的話，應儘量使其
△
G
值不要過高（應小於
4。5kcal/mol
，
G
值是指
DNA
雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部鹼基對的
相對穩定性
），否則易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而阻礙
PCR
反應的正常進行。
5′ 端中間G值應較高3′ 端較低
△
G
值是指
DNA
雙鏈
形成所需的
自由能
，它反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩定性，
△
G
值越大，則雙鏈越穩定。應當選用
5′
端和中間
△
G
值相對較高，而
3′
端
△
G
值較低（絕對值不超過
9
）的引物。引物
3′
端的
△
G
值過高，容易在錯
配位點
形成雙鏈結構並引發
DNA
聚合反應。（不同位置的
△
G
值可以用
Oligo 6
軟體進行分析）
5′ 端可以修飾
引物的
5′
端決定著
PCR
產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物
5′
端修飾包括：附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。
單鏈
無二級結構
某些引物無效的主要原因是擴增產物單鏈二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關軟體（比如
RNAstructure
）可以預測估計
mRNA
的穩定二級結構，有助於選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（
△
G°
）小於
58。6l kJ/mol
時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用
7-deaza-2′-
脫氧
GTP
取代
dGTP
對擴增的成功是有幫助的。
自由能
G
值是指
DNA
雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩定性。應當選用
3’
端
G
值較低（絕對值不超過
9
），而
5’
端和中間
G
值相對較高的引物。引物的
3’
端的
G
值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構並引發
DNA
聚合反應。
特異性
引物設計
完成以後，應對其進行
BLAST
檢測。如果與其它
基因
不具有
互補性
，就可以進行下一步的實驗了。透過比對，檢測設計引物，在已經發現並在
GENEBANK
中公開的全部物種
基因
序列當中，除了和你的目標基因之外，還有沒有和其他序列互補，如有則可能擴出其他序列的產物，那麼這個引物的
特異性
不強，應棄用。
且
引物設計
時應該考慮到引物要有不受
基因組
DNA
汙染影響的能力，即引物應該跨
外顯子
，最好是引物能跨外顯子的接頭區，這樣可以更有效的不受基因組
DNA
汙染的影響。
總結
引物的功能是起始
DNA
的擴增合成，理論上它是
PCR
特異性反應的關鍵，畢竟
PCR
產物的特異性就取決於模板
DNA
與引物之間互補的程度，因此就有了上文給大家的科普知識。但由於
PCR
技術具有極高的敏感性
，
擴增產物總量的變異係數常常達到
10%
30%
。因此，人們普遍認為應用簡單方法對
PCR
擴增的產物進行最終定量是不可靠的。實時定量
PCRC
（
real time quantitative PCR，qPCR
）技術的出現解決了這個問題，即利用帶熒光檢測的
PCR
儀對整個
PCR
過程中擴增
DNA
的累積速率繪製動態變化圖
，
消除了在測定終端產物丰度時有較大變異係數的問題。下期菌菌就帶大家學習
qPCR
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參考文獻
：
［1］
林萬明．
PCR
技術操作與應用指南．北京：人民軍醫出版社，
1993
［2］ PCR
引物設計及軟體使用技巧張新宇，高燕寧（中國協和醫科大學中國醫學科學院腫瘤研究所，北京
