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向聚丙烯醯胺沉澱物中再加入0.5倍體積丙烯醯胺凝膠洗脫緩衝液

作者:由 新課時代 發表于 繪畫日期:2022-04-17

用什麼洗脫凝膠

6。樣品用微量離心機以最大轉速於4‘C離心1lmin。將上清移入另一新的離心管中,應特別小心,不要將聚丙烯醯胺凝膠塊轉移進去(使用一根拉長的巴斯德吸管效果甚佳)。

7。向聚丙烯醯胺沉澱物中再加入0。5倍體積丙烯醯胺凝膠洗脫緩衝液。振盪片刻再次離心。合併兩次上清液。

8。 (可選做), 上清液透過一次性使用的塑膠層析柱(如IsoLab Quick-Sep柱)或裝有Whatman GF 1 C濾膜或充填矽化玻璃棉的注射器針簡,以除去殘留的聚丙烯醯胺凝膠塊。

向聚丙烯醯胺沉澱物中再加入0.5倍體積丙烯醯胺凝膠洗脫緩衝液

洗脫的DNA可用酚:氯傷和氯仿抽提以去除sDs,SDS能阻斷對DNA的後續酶促反應。然後按步驟9的方法用乙醇沉澱提取到的DNA並進行後續步驟。

9。將2倍體積的4’C預冷乙醇加到濾過液中,冰上放置30min。在微量離心機中以最大轉速於4‘C離心10min,回收DNA。可能由於洗脫液中存在少量聚丙烯醯胺,甚至很少量的DNA亦可被乙醇有效沉澱Gaillard and Strauss 1990)。

向聚丙烯醯胺沉澱物中再加入0.5倍體積丙烯醯胺凝膠洗脫緩衝液

而在沉澱前加入10μg tRNA (商業有售)可進一步提高小量DNA的回收率。必須確知RNA的存在不會干擾DNA的後續反應,方可加入RNA。

10。用200uL TE (pH 8。0)溶解DNA,再加入25μL 3mo/L乙酸鈉溶液(pH 5。2),然後按步驟9的方法用2倍體積的乙醇再次沉澱DNA。

11。用70%乙醇小心洗滌DNA沉澱。採用TE (pH 8。0)溶液溶解DNA至終體積10μL。