熒光檢測器用來檢測什麼
劉妍 1 李向麗 1 李曉璐 1* 中山火炬職業技術學院 廣東中山 528436
摘 要：以地塞米松為代表的糖皮質激素非法新增現象，仍然是我國動物源性食品安全的重要隱患。研究透過熒光微球免疫層析技術，對地塞米松進行了定量檢測。結果發現，所建立的地塞米松檢測方法IC50為0。87 ng/mL，線性範圍為0。1~8。4ng/mL（y =-0。18ln x+0。92，R2=0。99）。檢測組織樣本的最低檢出限為0。7μg/kg，平均相對標準偏差<30%（n=6）。使用30%的甲醇水溶液能一步完成提取過程，平均回收率為78%。
地塞米松（圖 1 a）作為一種長效的糖皮質激素，具有良好的抗炎 抗過敏作用，被廣泛用於動物疾病治療。然而，一些 研究指出，地塞米松因其促進動物生產功能而被非法濫用。在一些功能食品、保健品甚至是一些中藥材中，不法商販透過非 法新增糖皮質類激素，使消費者在食用後短期內出現一些積極作用，但若長期食用則會引起內分泌失調、致畸、致癌、致突變、水腫、糖尿病等不良反應。在化妝品方面，由於糖皮質類激素可以抑制細胞增生，減少 5- 羥色胺的形成，從而對面板有一定的嫩白作用 。但在長期使用後，就會造成人體面板變薄、毛細血管擴張和毛囊萎縮，輕度受害者會面板會恢復到使用前狀態，中度受害者會出現激素依賴性皮炎症狀，重度受害者則會造成更嚴重的後果，比如類固醇性糖尿病、骨壞死和骨質疏鬆、精神失常、消化性潰瘍和高血壓等疾病。因此我國農業部 235 號公告中對動物組織中地塞米松的限量做了具體的規定：肌肉為 0。75μg/kg，肝臟為 2g/kg。
目前動物組織中地塞米松的檢測方法主要有高效液相色譜法 ［1］、氣相色譜 - 質譜法 ［2］、液相色譜串聯質譜法［3］。雖然色譜方法準確性較高，然而儀器昂貴、操作繁瑣、環境要求高。農產品由於流通時間短（往往只有數小時），檢測方法如果耗時較長將無法實現餐前攔截。因此，建立相對準確、便宜、快速的地塞米松現場速測方法作為實驗室確證方法的補充，有利於完善農產品檢測初篩 - 確證的風險防控體系，保證農產品質量安全。
免疫層析檢測技術（Immunochromatographic Assay，ICA） 的快速發展為地塞米松的現場快速檢測提供了良好的技術基 礎。然而現有的地塞米松免疫層析方法主要基於膠體金標記，雖 然其能直接依靠肉眼觀察結果，但是靈敏度較差且定量不準
確，對於檢測地塞米松這種具有低限量值的藥物有一定的不便性。並且地塞米松是具有限量值的藥物，因此需要在量上判斷 是否超標，而膠體金的定量結果偏差較大。合成熒光素作為免疫反應的指示物能有效地提高免疫分析訊號，與膠體金標記相 比靈敏度可提高 10 ~ 100 倍 ［4］。然而，其容易光漂白且易被基質干擾，目前成功的免疫檢測產品仍然較少。近年來興起的熒光微球（fluorescent microspheres，FM）奈米材料為提高免疫層析靈敏度提供了新的解決方案，其透過將熒光素包裹在熒光微球中，避免了基質和熒光素的近距離接觸，從而避免了熒光訊號的淬滅 ［5］。並且該類微球已經商品化，批間穩定，標記方便。本研究採用熒光微球標記的免疫層析技術，實現了地塞米松的定量快速檢測。
1。 材料與方法
1。1 材料與試劑
硝酸纖維膜（NC 膜）、熒光矽球墊、樣品墊、吸水紙及 PVC 底板（美國 Millipore 公司）；FluoSpheres？ 氨基修飾的熒光微球（直徑 0。2 μm、激發波長 505 nm、發射波長 515 nm）（美國 Thermo 公司）；糖皮質激素類標準品（加拿大 TRC 公司）。其他試劑均為國產分析純。地塞米松羧基衍生物 （圖 1 b），地塞米松包被抗原（圖 1 c）和抗地塞米松單克隆抗體由深圳市計量質量檢測研究院提供。
1。2 儀器與裝置
圖片拍攝裝置為華為榮耀 8， 攝像頭覆蓋美國 BIOTEK 540nm±25nm 濾光片；505nm LED 光源 臺灣光宏；XYZ3100 點膜儀（美國 Bio-Dot 公司）；試紙條讀取儀（深圳市三方圓生物科技有限公司）；Milli-Q 水處理系統（美國 Millipore 公司）。
1。3 方法
1。3。1 地塞米松抗體 - 熒光微球偶聯物製備
將免疫微球，EDC，NHS按1：1：1的比例投料，並加入 1000 倍質量的去離子水。活化過夜後，離心去除上清加 入去 pH7。4 的 0。01M PBS 重懸。分別以抗體質量比微球質量 1：10、1：30、1：100、1：200 的投料比混合地塞米松抗體。反應 12 小時後，離心去除上清液，加入復溶液（含 1% BSA、2% 蔗 糖、0。05% PEG 20000、0。1% proclin 300 的 pH7。4 0。01M PBS 溶 液）重懸抗體 - 熒光微球偶聯物。
1。3。3 熒光試紙條的製備
熒光試紙條結果如圖 2 所示。首先將樣本墊浸泡於 20 mmol/ L 磷酸緩衝液（pH 7。4，含 1。0% BSA，0。25% Tween-20、1% PVP K-40、0。5% PEG 40000 和 0。1% NaN3）中，於 60 °C乾燥 2 h；將 地塞米松包被抗原（2。5 mg/mL）和羊抗鼠 IgG（0。 3 mg/mL）噴塗於 NC 膜上，分別作為 TTX 試紙條檢測線（T 線）和質控線 （C 線），於 37 °C真空乾燥 12 h。結合墊噴有 TTX 抗體偶聯熒光微球，室溫真空乾燥 12 h。最後將吸水紙、NC 膜、結合墊和經過預處理的樣本墊順序貼上在 PVC 底板上，用自動切條機切成 4 mm 寬的試紙條，室溫條件下真空乾燥，備用。
1。3。4 定量曲線的建立
以 T 線熒光訊號 /C 線熒光訊號（FIT/FIC）為縱座標，地塞米松標準溶液質量濃度的對數為橫座標，使用 Origin 8。0 建立四引數擬合曲線。
1。3。5 方法添加回收率選取色譜確證為地塞米松陰性的肌肉和肝臟樣品，地塞米松加標量為 1μg/kg 和 10μg/kg，放置過夜。取 1 g 均質的動物組織，加入 6mL 30% 甲醇水溶液（w/w），渦旋震盪 2 min，2000g 離心 5min，取上清液 0。1 mL 滴加至熒光免疫層析試紙的樣品墊，10 min 後讀取結果。
1。3。6 真實樣品的方法比對
在市場組織採購樣品 100 份（肝臟和肉各 50 份），使用本研究建立的方法和國標 GB/T 20741-2006 畜禽肉中地塞米松殘留量測定液相色譜 - 串聯質譜法所規定的方法進行對照檢測 ［23］。
2。 結果與分析
2。1 抗體免疫微球標記投料比
抗體和熒光微球的投料比是製備抗體熒光微球偶聯物的關鍵引數。抗體加入過多，會導致單個微球上帶入過多的抗體，檢測方法的靈敏度下降。而抗體加入不足，會導致部分微球無法偶聯抗體，則免疫層析的背景過高，同樣也會導致靈敏度下降。本研究試驗了 4 個梯度的投料比製備的抗體 - 熒光微球偶聯物。如圖 3 所示，抗體和熒光微球的投料比在 1：30 時，熒光免疫層析最為靈敏。
2。2 免疫層析反應時間
層析反應時間是熒光免疫層析的另外一個重要引數。本研究用空白的蒸餾水和 1。6ng/mL 的地塞米松標準溶液做10min 動態反應試驗。如圖4所示，免疫層析反應在8min時達到平衡，T 線的熒光值與 C 線的熒光比值不發生顯著變化。因此，該試紙在反應 8min 後即可進入熒光免疫層析掃描器讀數。
2。3 熒光免疫層析方法引數
FluoSpheres 氨基修飾的熒光微球是 Thermo 公司的商品化微球。據張世偉等報道，該微球製備的抗體 - 熒光微球偶聯物在 6 個月常溫儲存的熒光衰減< 40%，具有良好的穩定性 ［24］。根據微球說明書，該微球的激發範圍為 450-515nm，最佳激發波長為 505nm，發射波長為 505-580nm，最大發射波 長為 515nm。為避免激發和髮色光源的波長交叉引起的高背景，本研究選用 505nm LED 光源作為激發光源，並覆蓋 495nm ±20nm 濾光片避免雜光，在光檢測器前覆蓋 540±25 nm 濾光片消除背景。圖 5 展示了在暗室下使用覆蓋 495nm ±20nm 濾 光片的 505nm LED 激發，用手機攝像頭覆蓋 540±25 nm 濾光片的熒光微球免疫層析試紙條觀察結果。在 0。1ng/mL 地塞米松 可將試紙條 T 線熒光強度抑制到等同於 C 線，為該試紙的最低檢測靈敏度。在 8。4 ng/mL 時 T 線幾乎不可見，為線性範圍的最高值。
基於上述條件，本研究採用免疫層析熒光讀數儀對該試紙條建立標準曲線（圖 6），迴歸方程為 y = - 0。18ln x + 0。92（R2= 0。99）。以線性範圍的最低點 0。1 ng/mL 乘以其樣本前處理稀釋倍數 7 得到其最低檢出限為 0。7 μg/kg。糖皮質激素是一類結 構相似的藥物家族，表 1 展示了該方法檢測其他糖皮質激素的 交叉反應。該方法與醋酸地塞米松、倍他米松、倍氯米松等地 塞米松類似物具有一定的交叉反應。因此，在試紙條檢測的樣 品為陽性結果需要儀器確證時，需要同時檢測表 1 所示有交叉反應的藥物。
2。5 方法評價
糖皮質激素屬於脂溶性化合物，傳統的免疫學檢測方法需要使用有機溶劑萃取，吹乾，再用 PBS 復溶，前處理非常繁瑣，無法滿足現場檢測的需要 ［25］。本研究採用的熒光微球免疫層析方法具有良好的抗有機溶劑能力，可耐受 30% 的甲醇，因此可以使用 30% 的甲醇水進行提取後直接進行免疫分析，平均回收率可達到 78%（表 2）。本方法的在定量上的相對標準偏差和其他免疫學檢測方法總體相當，在 20%~30% 之間 ［24］。本研究從市場上隨機購買肌肉和肝 髒樣品各 50 份，分別用本研究建立的方法和國家標準 GB/T 20741- 2006 畜禽肉中地塞米松殘留量測定液相色譜 - 串聯質譜法進行比對檢驗。本試紙條結果為地塞米松未檢出的 93 個樣本，國標法也為地塞米松未檢出。本試紙檢測結果為陽性的 7 個樣本，有 3 個國 標法為地塞米松未檢出，其中的一個檢出倍他米松，另外兩個不符合樣品原因不明。4 個熒光微球免疫層析法和國標法均檢出的樣品定量對比如圖 6 所示。對於低含量的樣本，熒光微球免疫層析法的定量結果與國標法的吻合度較好。對於高含量的樣本，由於甲醇水提取效率的原因，熒光微球免疫層析法的定量結果低於國標法。然而，熒光微球免疫層析方法前處理簡單，裝置輕便易於攜帶，實驗 環境要求低，作為現場定量方法，具有顯著的優勢。
結語
以地塞米松為代表的糖皮質激素非法新增現象，目前仍然是我國動物源性食品安全的重要隱患。本研究將新型高靈敏度 熒光探針引入檢測地塞米松的免疫層析體系，建立的檢測熒光微球免疫檢測方法以商品化微球為標記物，製備方便，熒光信 號穩定。配合簡單的一步提取前處理方法，整個檢測過程僅需 15 min，且無需使用大型裝置，提高了地塞米松免疫層析技術 的靈敏度、特異性和穩定性，最終建立針對食品及化妝品中地塞米松熒光免疫層析現場快速檢測方法。該技術方法的建立對提高地塞米松檢測效率、降低檢測成本等具有重要實際意義，並 為食品及化妝品中小分子汙染物快速檢測方法提供新思路 ， 從而彌補了動物源性食品中地塞米松現場快速檢測技術的短板。
參考文獻
［1］閔春豔， 王鳴人， 吳楊， 等。 UPLC-MS/MS法檢測抗菌乳膏中的痕量地 塞米松和倍他米松［J］。 藥物分析雜誌， 2017，37（7）： 1248-1255。
［2］安彥，王衛，唐素芳等。頂空毛細管氣相色譜法測定地塞米松磷酸鈉有機 溶劑殘留［J］。天津藥學，2010，22（4）：12-14。
［3］裴昆， 劉荷英， 左麗平， 等。 液相色譜-串聯質譜法同時檢測消字號產品中的 地塞米松和氯倍他索丙酸酯［J］。 中國衛生檢驗雜誌， 2017， 27（21）： 3071-3076。
［4］Xu D， Wu X L， Li B， etal。 Rapid detection of Campylobacter jejuni using fluorescent microspheres as label for immunochromatographic strip test［J］。 Food Science and Biotechnology， 2013， 22（2）： 585-591。 DOI：10。1007/s10068-013-0118-5。
［5］Zhang X Y， Wen K， Wang Z H， et al。 An ultra-sensitive monoclonal antibody-based fluorescent microsphere immunochromatographic test strip assay for detecting aflatoxin M1 in milk［J］。 Food Control， 2016， 60： 588-595。 DOI：10。1016/ j。foodcont。2015。08。040。